細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

第三章細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
1. 細(xì)胞培養(yǎng)(HEK293T)
1) 顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，去上清；
2) 加入預(yù)熱的PBS 3ml, 溫柔地清洗細(xì)胞,棄去PBS；
3) 用胰蛋白酶消化細(xì)胞，通常75cm2 培養(yǎng)瓶的貼壁細(xì)胞用3ml 胰蛋白酶于37oC
處理5min；
4) 待細(xì)胞脫落后，加入5ml DMEM 培養(yǎng)液(含10%FBS)以終止消化反應(yīng)，并將
細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入15ml 或50ml 離心管中；
5) 1000rpm 離心5min，去除上清；
6) 加入10ml DMEM 培養(yǎng)液(含10%FBS)，重新懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞充分打散；
7) 進行細(xì)胞計數(shù),(4 個大方格細(xì)胞數(shù)的均值×104 個為每ml 所含細(xì)胞數(shù))；
8) 根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，將適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)接入含有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶
或皿中；(**天做轉(zhuǎn)染，A.Fugene6 法--細(xì)胞總量應(yīng)達4-5×106 /10cm 培養(yǎng)
皿; B. 磷酸鈣法: 細(xì)胞總量應(yīng)達3×106 / 10cm 培養(yǎng)皿)；
9) 置于37 ℃ 5％CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (注意培養(yǎng)箱應(yīng)有足夠的水分)。
注：以上所使用的胰蛋白酶、培養(yǎng)液等在使用前都置于37℃水浴中預(yù)熱，以減
小對細(xì)胞的刺激。
2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
2.1 脂質(zhì)體介導(dǎo)的貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染法
以下針對293T 細(xì)胞、10cm 培養(yǎng)皿
目前主要使用試劑盒為Roche 公司的FuGENETM6 Transfection Reagent
1) 轉(zhuǎn)染前24 小時以4-5×106 /10cm 培養(yǎng)皿的細(xì)胞總量鋪板，當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)
第三章細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
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良好且貼壁細(xì)胞密度達到50~80%時即可進行轉(zhuǎn)染；
2) 在1.5ml 離心管中加入需要共轉(zhuǎn)的2 種質(zhì)粒DNA 各5μg，混勻。
3) 將50μl FuGENE6 脂質(zhì)體加入500μl DMEM(serum free)培養(yǎng)液(注意不要
將FuGENE6 脂質(zhì)體沾到管壁)，加入前述DNA，輕輕混勻，RT 培養(yǎng)30 分
鐘；
4) 將含有DNA 和脂質(zhì)體的液體小心加入到培養(yǎng)皿中，分散均勻，置于37 ℃ 5
％CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24－48 小時。
2.2 磷酸鈣介導(dǎo)的貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染法

以下針對293T 細(xì)胞、10cm 培養(yǎng)皿(參照《分子克隆實驗指南(第三

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細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染